Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Главная задача проекта – разработать и экспериментально валидировать новый метод широкомасштабного функционального картирования когнитивных нейронных сетей целого мозга животных, используя технологию опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации. В 2014 году для решения этой задачи были: а). получены двойные трансгенные линии мышей путем скрещивание линий, несущих ген тамоксифен-зависимой CreERT2 рекомбиназы B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J, B6.129(Cg)-Arctm1.1(cre/ERT2)Luo/J и репортерной линии, несущей ген зеленого флуоресцентного белка под loxP-фланкированным стоп-сигналом STOCK Tg(CAG-Bgeo/GFP)21Lbe/. Благодаря этому в проекте получены двойные трансгенные линии репортерных мышей, у которых зеленый флуоресцентный белок eGFP экспрессируется на фоне введения тамоксифена или его производных только в fos- или Arc-активирующихся клетках – линии fos-Cre-eGFP и Arc-Cre-eGFP, соответственно; б). произведено иммуногистохимическое выявление Cre-зависимой рекомбинации по флуоресцентному белку eGFP на срезах мозга полученных двойных трансгенных животных и установлено, что обучение к появлению распределенных популяций eGFP-положительных нейронов в различных структурах мозга, что свидетельствует о том, что нейроны этих животных, вовлекаясь в когнитивную активность, специфически экспрессируют Cre-рекомбиназу под промоторами немедленных ранних генов c-fos или Arc; в). проведена совместная визуализация Cre-зависимой рекомбинации и экспрессии эндогенного белка c-Fos на одних и тех же срезах мозга двойных трансгенных мышей линии fos-Cre-eGFP, показавшая, что Cre-зависимая рекомбинация, вызванная обучением, происходит в нейронах, которые селективно вовлекаются именно в экспериментально индуцируемый когнитивный эпизод, без существенной фоновой экспрессии; г). с помощью двойной иммуногистохимической окраски проведено исследование типов клеток мозга, в которых происходит опыт-зависимая Cre-рекомбинация и было показано, что все eGFP-положительные клетки содержат маркер дифференцированных нейронов NeuN, но никогда не окрашиваются антителами на GFAP (глиальный маркер), т.е. являются специфически зрелыми нейрональными клетками; д). апробирован метод томографического выявления сети когнитивно идентифицированных нейронов в масштабе целого мозга мыши после опыт-зависимого Cre-Lox фингерпринтинга - проведена серийная двухфотонной томография мозга животных двойной трансгенной линии fos-Cre-eGFP и показано, что этот метод позволяет исследовать паттерны распределения когнитивно идентифицированных нейронов в масштабе целого мозга; е). апробирована возможность выявления микроструктуры локальных нейронных сетей мозга методом Cre-Lox фингерпринтинга - проведены эксперименты по визуализации локальных нейронных сетей в мозге мышей трансгенной линии CaMKII-Cre-Brainbow 1.0, показавшие возможность выявления отдельных нейронов индивидуально окрашенных палитрой флуоресцентных белков Brainbow. В 2015 г. планируется: а). разработать комплекс методов, позволяющих проводить визуализацию и количественный анализ вовлечения когнитивно-индексированных нейронов в формирование двух форм памяти, используя технологию опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации и б). обратиться с помощью разрабатываемого похода к клеточно-сетевому исследованию мозговых субстратов и принципов формирования условных связей в экспериментальной модели усиления памяти предэкспозицией к обстановке («context pre-exposure facilitation»), позволяющий сравнивать клеточные сети неассоциативной и ассоциативной памяти в мозге одного и того же животного.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Главная задача настоящего проекта – разработать и экспериментально валидировать новый метод функционального картирования когнитивных нейронных сетей мозга животных с помощью технологии опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации. Проект реализуется в три этапа. На первом этапе, в 2014 году были получены двойные трансгенные линии репортерных мышей, у которых зеленый флуоресцентный белок eGFP экспрессируется только в активированных когнитивным опытом Fos- или Arc-экспрессирующих нейронах, были отработаны методы одновременного выявления Cre-зависимой рекомбинации и экспрессии эндогенного белка c-Fos на срезах мозга двойных трансгенных животных и апробирован метод томографического выявления сетей когнитивно идентифицированных нейронов с помощью серийной двухфотонной томографии. В 2015 году решались три последующих группы задач проекта. Прежде всего, была отработана новая модель ассоциативного обучения у мышей, которая будет использована на третьем этапе проекта для валидации разрабатываемой технологии Cre-Lox функционального нейрокартирования в модели ассоциативного обучения. Ее особенностью является то, что она впервые позволяет раздельно и с большим интервалом во времени (как показали проведенные эксперименты, до 30 дней) нанести мыши два ассоциируемых воздействия, чтобы далее с помощью разрабатываемой технологии Cre-Lox фингерпринтинга исследовать закономерности коаллокации этих двух когнитивных событий в нейронных сетях мозга. В проведенных экспериментах было также продемонстрировано, что память о каждом из этих когнитивных событий является специфической и долговременной. Кроме того, методами с-Fos-нейроимиджинга было установлено, что одним из локусов формирование данной специфической формы ассоциативной памяти, по-видимому, является зона СА1 гиппокампа, где наблюдается значимо большая активация у ассоциативно обученных мышей, и в которой поэтому целесообразно будет далее проводить картирование клеточной коаллокации памяти методом Cre-Lox фингерпринтинга. Все эти данные были получены впервые и представляют также самостоятельную фундаментальную ценность, выходящую за пределы этапной задачи настоящего проекта. Далее, в 2015 году был разработан комплекс методов, позволяющих проводить визуализацию и количественный анализ вовлечения когнитивно-индексированных нейронов в формирование неассоциативной и ассоциативной памяти при помощи технологии опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации. Для этого вначале была исследована динамика накопления в нейронах белка с-Fos после эпизода обучения и выбран пик на 90 мин для последующего анализа коэкспрессии с-Fos с eGFP, накопленным от Fos-Cre-Lox эпизода рекомбинации. Затем было проведено совместное картирование Cre-зависимой рекомбинации и экспрессии эндогенного белка c-Fos в нескольких моделях двойных когнитивных воздействий у мышей и охарактеризованы топографические особенности перекрывающихся при этом популяций нейронов. В частности, в модели обучения, отработанной в первой задаче проекта (модель усиления памяти при предэкспозиции к обстановке) колокализация двух маркеров была выявлена в паравентрикулярном ядре таламуса и в базолатеральном ядре миндалины. Это позволило сосредоточить решение следующего этапа данной задачи (отработку визуализации сетей когнитивно-идентифицированных нейронов в объеме целой структуры головного мозга) на миндалевидном комплексе мозга мыши и провести трехмерную реконструкцию активируемой в нем популяции нейронов методом их маркирования Cre-Lox рекомбинацией. Наконец, на третьей стадии работ 2015 года было проведено исследование молекулярного и морфологического фенотипа нейронов гиппокампа и неокортекса, подвергающихся опыт-зависимому Cre-Lox фингерпринтингу при формировании контекстуальной памяти. Было показано, что эти клетки относятся к типу возбуждающих пирамидных нейронов, коэспрессирующих eGFP и CaMKII как в разных слоях неокортекса, так и в пирамидном слое зоны СА1 и гранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа. Примечательно, что в тормозных интернейронах неокортекса, экспрессирующих парвальбумин, соматостатин или NPY такой колокализации экспрессии выявлено не было. Эти данные, полученные также впервые, не только демонстрируют новые разрешающие возможности разрабатываемой технологии нейрокартирования методом опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации, но и представляют самостоятельный фундаментальный интерес в плане выявления клеточных субстратов долговременной памяти в гиппокампе и коре головного мозга. Далее, в соответствии с общим планом проекта, в 2016 году будет проведена валидация технологии Cre-Lox функционального нейрокартирования на разработанной в 2015 г. модели ассоциативного обучения, позволяющей выявлять в одном мозге нейронные сети двух раздельных когнитивных событий. Для этого будет количественно оценена нейронная коаллокация двух форм памяти (ассоциативной и неассоциативной), формирующихся у животных в модели усиления памяти при предэкспозиции к обстановке путем совмещения технологии опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации и классического с-Fos нейроимиджинга. Будет также проведено молекулярное фенотипирование типов нейронов, вовлекающихся в формирование неассоциативной памяти об обстановке, и нейронов, активирующихся при формировании ассоциативной памяти. Для развития методов многоцветного имиджинга и выявления связей нейронов в генетически захваченной когнитивной сети, будут впервые получены двойные трансгенные мыши, содержащие генетический конструкт Brainbow под контролем Fos-Cre-системы. С помощью многоцветной линии Fos-Cre-Brainbow будет проведена визуализация когнитивно-индексированной сети нейронов после получения животными нового опыта. Это позволит завершить запланированный цикл разработки технологии визуализации когнитивных сетей головного мозга методом опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации и валидировать ее на специально созданной для этого на мышах модели расставленного ассоциативного обучения.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Главная задача настоящего проекта – разработать и экспериментально валидировать новый метод функционального картирования когнитивных нейронных сетей мозга животных с помощью технологии опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации. Проект реализуется в три этапа. На первом этапе, в 2014 году были получены двойные трансгенные линии репортерных мышей, у которых флуоресцентный белок экспрессируется только в активированных когнитивным опытом Fos-экспрессирующих нейронах, были отработаны методы одновременного выявления Cre-зависимой рекомбинации и экспрессии эндогенного белка c-Fos на срезах мозга двойных трансгенных животных и апробирован метод томографического выявления сетей когнитивно идентифицированных нейронов. На втором этапе, в 2015 году была отработана новая модель ассоциативного обучения у мышей. Особенностью такой модели являлось то, что она впервые позволила раздельно и с большим интервалом во времени нанести мыши два ассоциируемых воздействия. Также был разработан комплекс методов, позволяющих проводить визуализацию и количественный анализ вовлечения когнитивно-индексированных нейронов в формирование неассоциативной и ассоциативной памяти при помощи технологии опыт-зависимой Cre-Lox рекомбинации. Кроме того, в 2015 году было проведено исследование молекулярного и морфологического фенотипа нейронов гиппокампа и неокортекса, подвергающихся опыт-зависимому Cre-Lox фингерпринтингу. Было показано, что эти клетки относятся к типу возбуждающих пирамидных нейронов. В 2016 году решались четыре следующие группы задач проекта: 1. Выявление мозговой топографии когнитивных нейронных сетей различных форм памяти, вхождения в них нейронов различных областей головного мозга и участия в них нервных клеток определенных морфологических типов. С помощью классического с-Fos-нейроимиджинга в мозге мышей линии C57Bl/6 была исследовано активация различных структур мозга при извлечении ассоциативной и неассоциативной форм памяти в модели усиления памяти при предэкспозиции к обстановке. Было показано, что извлечение ассоциативной памяти, в отличие от неассоциативной, приводит к массированной активации структур мозга. Извлечение ассоциативной памяти сопровождалось активацией ассоциативных областей неокортекса, зон СА1 и СА3 гиппокампа, а также ядер миндалины. При этом специфическая активация при извлечении неассоциативной памяти наблюдалась только в зоне СА1 гиппокампа. Кроме того, было проведено определение молекулярных типов нейронов, вовлеченных в извлечение ассоциативной и неассоциативной памяти. Было показано, что извлечение ассоциативной памяти сопровождается активацией как возбуждающих пирамидных клеток, так и тормозных интернейронов. Был проведен количественный анализ коаллокации (перекрывающейся клеточной локализации следов памяти) двух форм памяти (ассоциативной и неассоциативной), в нейроны различных структур мозга репортерной Fos-Cre линии трансгенных мышей путем совмещения Cre-опосредованного пожизненного мечения активированных нейронов с иммуногистохимической окраской на эндогенный с-Fos в модели усиления памяти предэкспозицией к обстановке. С помощью опыт-зависимой Cre-рекомбинации пожизненной экспрессией репортерного флуоресцентного белка была помечена популяция нейронов, активированных при обследовании и запоминании животным новой нейтральной обстановки. Нейроны, активировавшиеся при нанесении немедленного электрокожного раздражения (ЭКР), были помечены по синтезировавшемуся в них белку с-Fos. Вовлечение нейронов в формирование ассоциативной памяти было оценено по колокализации обоих маркеров – флуоресцентного белка tdTomato и с-Fos. Было показано, что при формировании ассоциативной памяти происходит активация преимущественно тех же нейронов ассоциативных областей неокортекса, зоны СА1 и зубчатой фасции гиппокампа, а также ядер миндалины. При этом, такого перекрытия двух популяций активировавшихся нейронов не наблюдалось в зоне СА3 гиппокампа и моторной области неокортекса. Таким образом, впервые было показано, что формирование памяти в модели ассоциации уже имеющегося следа об обстановке с подкреплением происходит, когда при обследовании новой обстановки и нанесении немедленного ЭКР активируются перекрывающиеся распределенные популяции нейронов. 2. Одновременная визуализация двух различных когнитивно индексированных популяций нейронов в объеме целой структуры головного мозга. В 2016 году была разработана методика трехмерной визуализации двух популяций нейронов в масштабе целой структуры мозга – миндалины. С помощью данной методики была впервые проведена одновременная визуализация двух популяций нейронов миндалины, активных при формировании ассоциативной и неассоциативной памяти у одного и того же животного (путем совмещения Cre-опосредованной экспрессии tdTomato и экспрессии эндогенного с-Fos). Данная методика позволит в дальнейшем исследовать пространственное соотношение в рамках отдельных структур мозга между различными популяциями когнитивно-активных нейронов в самых различных моделях и задачах когнитивной нейробиологии. 3. Многоцветная визуализация когнитивно-индексированной сети нейронов после получения животными нового опыта. Впервые были получены двойные трансгенные мыши, у которых генетический конструкт Brainbow 3.2, обеспечивающий цветовую дискриминацию индивидуальных нейронов и их отростков за счет экспрессии в них в разных пропорциях трех различных флуоресцентных белков, находится под контролем Fos-опосредованной Cre-рекомбиназы. Такой генетический конструкт позволил выявить структуру нейритов и связей индивидуальных клеток, которые были активны в связи с приобретением нового когнитивного опыта (обучение в модели условно-рефлекторного замирания). Данная методика является уникальной в мире и была впервые разработана в рамках выполнения данного проекта. 4. Анализ связи когнитивно-индексированных нейронных сетей, вовлекавшихся в формирование ассоциативной памяти, с поддержанием и последующим проявлением ассоциативной памяти в поведении. Впервые была показана возможность применения технологии пожизненного Cre-lox фингерпринтинга когнитивных сетей для решения вопроса о роли популяций нейронов, составляющих след распределенной сети когнитивного опыта, в воспроизведении данного опыта. Для решения данной задачи у мышей линии Fos-Cre при помощи опыт-зависимой Cre-рекомбинации пожизненной экспрессией репортерного флуоресцентного белка была помечена популяция нейронов, активированных при обучении в модели отставленного условно-рефлекторного замирания на звуковой сигнал («trace fear conditioning»). Память о звуковом сигнале была протестирована, и животные были разделены на хорошо и плохо обучившихся. Было проведено сопоставление активности нейронов миндалины и гиппокампа при обучении и способности животных к воспроизведению долговременной памяти в данной задаче.